敌人不止一个:战胜了章鱼博士后，彼得（托贝·马奎尔）找到了做蜘蛛侠的感觉，他越来越享受作为一个超级英雄在城市里四处飞来荡去、被万人敬仰崇拜，他和玛丽珍（克尔斯滕·邓斯特）的关系也步入稳定期，事业爱情双得意，本着救世的善心才披上蜘蛛衣的彼得也开始自我膨胀，这也埋下他几乎踏入万劫不复境地的导火索。
其实在彼得心里一直有个结，就是本叔叔的死，在第一部里被他追到楼顶堕楼惨死的小偷其实并不是真正的凶手，一次偶然的机会，彼得得知一个名叫佛林特·马克（托马斯·哈登·丘奇）的逃犯极有可能是害死叔叔的真凶，他悄悄避过警察亲自出马杀死马克泄愤；可表面与常人无异的马克其实已在实验室被改变了基因成为身体能幻化成沙并卷起沙尘暴的“沙人”，被复仇之火遮了眼的蜘蛛侠和“沙人”展开连番恶战。
彼得的战衣不巧在这时坏了，恰好这时一个科学怪人在陨石里找到一种神奇的共生体，这种像黑色小蚯蚓的物质附着到彼得身上，竟完全改变了旧蜘蛛衣的性状：更贴体型的黑蜘蛛衣能自我修复，能让彼得体能与跳跃、织网的能力更强，穿着黑战衣战斗更得心应手的彼得对自己的战绩愈发骄傲，深爱他的玛丽珍对此感到很不满，而得知蜘蛛侠真实身份而前来复仇的哈利（詹姆斯·弗兰科）也趁机介入二人之间挑拨离间。
黑蜘蛛衣不但赋予彼得更快的速度、更强的力量，它更是有着自我意识的狡猾邪物，体会到彼得要为叔叔报仇的怒火和他内心的自满后它借此控制彼得的意识，发觉自己的灵魂与身体逐渐被战衣的精神占据，彼得非常害怕，他急于摆脱黑战衣，就在他和化身成战衣的共生体纠缠的时候，一个命中注定的仇家出现了。
埃迪·布洛克（托弗·戈瑞斯），职业是狗仔队，和彼得在同一家报馆供职，最近运道霉透了，他的女人抛弃了他喜欢上蜘蛛侠，他好不容易搞来的新闻也被蜘蛛侠捣毁了，他恨死蜘蛛侠却拿他没办法；万念俱灰，到教堂作最后祈祷的他，决定在钟楼里了此余生，却正好被从蜘蛛侠身上硬生生剥下的黑色共生体碰到了，共生体体会到他内心的仇恨，迅速进入他的身体，把它赠与蜘蛛侠的超凡能力附加在布洛克身上，一个致命的反派-“毒液”诞生了！
如果说《蜘蛛侠2》是彼得完成外在身份自我认可的过程，《蜘蛛侠3》则是他两个身份内心的艰苦斗争，而给他火上浇油的坏家伙从惯例的单打独斗增加到三比一的压倒性威胁，所以，如果第二部《蜘蛛侠》已经让你感到心底一阵寒蝉的观众要小心了，从外星和实验室里来的“朋友”将会让纽约的天空布满更压抑的阴霾。

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